События разворачиваются сразу после финала Assassin's Creed 2.

Учёные продолжают исследовать генетическую память Дезмонда Майлза и изучать жизнь его предка Эцио Аудиторе де Фиренце. В новой игре мы видим, как молодой человек, знакомый нам по предыдущим частям, становится взрослым мужчиной около сорока пяти лет. Он является одним из лидеров и наставников ордена ассасинов.

Эта часть игры — одна из трёх, посвящённых Эцио. Две другие части были довольно типичными, но эта выделяется своей уникальностью.

В этой части мы продолжаем следить за приключениями ассасинов и искать ответы на вопросы о таинственном «Яблоке», которое обладает огромной силой. Найдут ли они его — это вопрос, который остаётся открытым.

Дополнение DLC:
"Da Vinci Disappearance": Эцио (Ezio) придется спасти Леонардо да Винчи, похищенного приверженцами культа герметизма, задумавшими изменить человечество, а также вернуть украденные полотна руки средневекового художника и изобретателя.

Выполняя миссию, протагонист обнаружит две новые локации и будет использовать две новые «геймплейные возможности».