Действие игры Portal 2 разворачивается через несколько сотен лет после событий первой части. Главная героиня, девушка по имени Челл, приходит в сознание в заброшенной лаборатории, где проводились исследования порталов. Лаборатория находится на территории комплекса корпорации Aperture Science и заросла буйной растительностью.

В руки Челл снова попадает устройство для создания порталов. Её цель — выбраться на поверхность. Во время своего путешествия она встречает Уитли, одного из модулей личности, которые активировались в конце первой части игры. Уитли обеспокоен состоянием лаборатории и надеется на помощь Челл. Взамен он предлагает ей путь на поверхность.

Вместе они исследуют разрушенные помещения и всё ещё работающие цеха Aperture Science. Когда они достигают места со спасательной капсулой, Уитли пытается подключить её к питанию, но происходит сбой, и платформа с персонажами поднимается к площадке, на которой лежат остатки главного врага Челл — суперкомпьютера ГЛэДОС, который она уничтожила в первой части игры.

Прямо на глазах у Челл ГЛэДОС восстанавливает себя и узнаёт девушку. Сначала она не спешит с местью, а начинает реконструкцию лаборатории. Челл снова оказывается вовлечена в испытания с порталами.